一文看懂：ChIP实验和qPCR定量分析怎么做_ChIP实验和qPCR定量分析的技巧与要点

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一种探究蛋白质与DNA在体内如何相互作用的经典技术。
开始ChIP之前要考虑三件事
（1）为您的实验寻找合适的抗体
（2）优化染色质剪切
（3）评估您的ChIP实验是否可行
五个步骤实现理想ChIP结果
Step1：交联和裂解——固定复合物并分离核组分
这一步要求时间精确并且需要优化。通过体内共价交联，将蛋白质-DNA相互作用固定下来，并在特定的时间点进行分析。常用的交联方法是甲醛交联，然后用甘氨酸终止反应。交联剂能够渗透到完整的细胞中，并将蛋白质-DNA复合物固定在一起，以便进行分析。交联剂在整个过程中维持复合物的稳定性，但是它的作用必须是可逆的，才能用于ChIP。一些非常稳定的蛋白质-DNA相互作用则无需交联。
接下来，用裂解液破坏细胞膜，释放出细胞组分，使得蛋白质-DNA复合物变为可溶。去除细胞溶质蛋白，以降低背景信号并提高灵敏度。
注意：此时可以暂停ChIP测定。在交联、淬灭和洗涤细胞沉淀后，可以将裂解物存放在-80℃。
Step2：染色质片段化——DNA片段化
细胞核材料的片段化是影响ChIP分辨率的关键因素，理想的片段大小在200到800 bp之间。片段化是最难控制的步骤之一。可以通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化来实现片段化，两者各有优缺点。超声处理需要大量的手工操作时间，但是非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手工操作，适合大批量样品的处理，但是它的片段化位点不是随机的。两种方法都需要根据具体的细胞系进行优化。
注意：此时可以暂停ChIP。在片段化/消化染色质后，可以将样品存放在-80℃。避免反复冻融。
Step3：免疫沉淀——捕获并分离蛋白质-DNA复合物
使用抗体来捕获蛋白质-DNA复合物中的目标蛋白质是实验成功的关键因素。抗体能够免疫沉淀并从细胞核组分中分离出蛋白质，去除无关的细胞物质。
使用抗体结合的磁珠来纯化得到的抗体-蛋白质-DNA复合物。在孵育后，充分洗涤磁珠-抗体-蛋白质-DNA复合物，纯化并洗脱蛋白质-DNA复合物。
Step4：制备DNA——解交联和DNA纯化
现在已经分离出含有目标蛋白质的染色质片段，需要解交联并纯化DNA。解交联通常采用高温孵育和/或消化来完成。
注意：此时可以暂停ChIP。在解交联和/或DNA纯化后，可以将样品存放在-20℃。
Step5：定量DNA——测定目标蛋白质-DNA水平
在这一步中，通过qPCR定量纯化的DNA产物，通过qPCR，您可以确定目标蛋白是否存在于特定的位点。
ChIP的qPCR如何定量分析
ChIP-qPCR数据需要针对可变性来源进行标准化，包括染色质的数量、免疫沉淀的效率（富集效率）和DNA的回收率。
两种常用的标准化ChIP-qPCR数据方法——Percent Input法和富集倍数法（Fold Enrichment）。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准化。建议ChIP实验重复，尽可能将结果与背景信号和标准误差一起显示。